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    酶標記抗體-HRP標記抗體方法及標記步驟?

    發布時間:2022-09-06瀏覽次數:67返回列表

      標簽:古朵生物 酶標記抗體 HRP標記抗體


      酶標記抗體-HRP標記抗體方法及標記步驟?


      HRP標記抗體的方法

      酶與抗體交聯的方法有許多種, 根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備 HRP 結合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法為常用。

      戊二醛二步法

      1. 原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。

      2. 標記步驟:

      (1)稱取 HRP25 mg 溶于 1.25% 戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。

      (2)反應后的酶溶液經 Sephadex G-25 層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在 1 ml/1 分鐘,收集棕色流出液。如體積大于 5 ml,則以 PEG 濃縮至 5 ml。放置25 ml 小燒杯中,緩慢攪拌。

      (3)將待標記的抗體 12.5 mg 用生理鹽水稀釋至 5 ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。

      (4)用 1M PH9.5 碳酸緩沖液 0.25 ml,繼續攪拌 3 小時。

      (5)加 0.2M 賴氨酸 0.25 ml,混勻后,置室溫 2 小時。

      (6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置 4℃ 1 小時。

      (7)3000 rpm 離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,后沉淀物溶于少量 0.15 M PH7.4 的 PBS 中。

      (8)將上述溶液裝入透析袋中,對 0.15 M PH7.4 的 PB 緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000 rpm離心 30 分鐘去除沉淀,上清液即為酶結合物,分裝后,冰凍保存。

      3. 結果判定:

      (1)定性及效價滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定 其活性。后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定(見本節(三)工作濃度的選擇)。

      (2)定量和克分子比值測定:可用分光光度計測定(光程 1 cm)。

      酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4

      IgG 量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg/ml)IgG 量(mg/ml)酶量

      克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 440,000 160,000 IgG量(3)本法標記步驟比較簡單,重復性好。缺點是酶的利用率低,一般只有2~4% 的酶與蛋白質結合。

      酶標記抗體-HRP標記抗體方法及標記步驟?上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品,勵志研發和銷售的綜合性生物公司,產品遠銷多個國家和地區,我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求”的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向,不斷開發高質量的新產品,提供客戶滿意的綜合服務質量”的方針。

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